迄今为止，许多现代分析技术或方法已被广泛应用于植物样品中代谢分子的定性和定量分析，如液相色谱-质谱 (LC-MS)，气相色谱-质谱 (GC-MS)，毛细管电泳-质谱 (CE-MS)，核磁共振 (NMR) 等。此外，包括解吸电喷雾电离质谱 (DESI-MS)、实时直接分析质谱 (DART-MS)等原位分析技术，也逐渐被应用于植物代谢组学研究中。尽管这些技术的不断发展和完善极大地提高了对植物组织样本中代谢分子的表征能力，但LC/GC/CE-MS、NMR技术过度依赖于代谢分子的高效提取、分离与富集，多步操作流程不仅容易造成代谢分子不可避免的损失，进而不能准确反映生物样本的真实状态，而且费时费力通量性不高；DESI/DART-MS技术并不能完全克服植物组织特殊的多层结构限制 (如蜡质层、角质层、细胞壁等)，极大地制约了植物样本内源性代谢分子高效检测与充分表征。因此，上述技术的应用仍不能很好满足科学家对植物内源性分子进行全面、综合、深度研究的需求。因此，迫切需要建立一种更简便、更快速、更高效的植物代谢组学分析技术。
近日，中央民族大学生命王晓东教授团队在植物学知名期刊《Plant Biotechnology Journal》(SCI影响因子13.8) 在线发表题为"High-throughput MALDI-MSI metabolite analysis of plant tissue microarrays”的研究论文。该研究开发了一种新型代谢组学分析技术，名为：基于植物组织微阵列的基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术(MALDI-MSI-PTMA)，并成功将其应用于植物组织内源性代谢分子高通量检测与成像表征。MALDI-MSI-PTMA不仅完全克服了由于植物组织特殊结构 (如表皮蜡质、角质、细胞壁) 的限制而无法高效检测内部代谢分子的缺点，而且该技术操作简单无需提取、分离、富集等多步样本前处理过程，完全避免了内源性分子不必要的损失；此外，结合该技术高通量性的优势特点，MALDI-MSI-PTMA的应用极大地增强了植物代谢分子的整体检测性能与可视化成像表征能力。研究表明MALDI-MSI-PTMA有潜力成为植物科学代谢组学研究中一种强有力的高通量分析技术。
MALDI-MSI-PTMA实验流程图
研究团队利用明胶分子成功制备了植物组织微阵列模具 (PTMA)。将选取的植物组织样本进行充分匀浆处理后即可获得包含植物组织内部全部代谢分子匀浆液；随后在低温条件下立即将组织匀浆液小心注入PTMA明胶模具中并放置于冷冻切片机内冷却，待其充分冷冻凝固后即可进行高质量冰冻切片；将植物组织微阵列切片融裱至ITO导电玻片上，待其干燥后利用基质喷涂装置进行基质包被，随后利用MALDI-MS仪即可进行植物组织代谢分子质谱高效检测与成像分析。
该研究首先评估了DHB、CHCA、2-MBT三种MALDI基质对岩青兰叶片组织的检测性能，结果发现2-MBT基质具有最少的背景峰干扰和最佳的代谢分子离子信号检测性能。因此选定2-MBT作为后续MALDI-MSI检测和成像基质。接着，研究团队比较了MALDI-MS对完整的岩青兰叶片组织、去除表皮蜡质岩青兰叶片组织、匀浆后注入PTMA模具岩青兰叶片组织代谢分子的检测性能，结果表明PTMA制备的组织切片MALDI-MS检测效能最佳。此外，研究团队随机选择了15种代谢分子离子信号 (包括：m/z 225.04, 242.15, 256.26, 269.19, 281.23, 559.14, 593.29, 607.08, 621.45, 645.26, 807.46, 871.55, 884.58, 911.56, 928.41) 对PTMA切片进行了MALDI-MS检测日内和日间稳定性评估，结果显示PTMA切片15种代谢分子离子信号强度均具有较好的日内、日间稳定性与重现性。
三种MALDI基质DHB、CHCA、2-MBT对岩青兰叶片组织代谢分子检测性能比较
三种岩青兰叶片组织 (完整、去除表皮蜡质、匀浆PTMA) MALDI-MS检测性能比较
PTMA切片MALDI-MS检测日内稳定性评估
PTMA切片MALDI-MS日间稳定性评估
最后，团队研究人员利用MALDI-MSI-PTMA技术成功地快速评价了两种植物生长调节剂处理 (6-BA和TDZ) 对组织培养获得的岩青兰样本内源性代谢分子表达的影响，并将其结果与LC-MS获取的代谢物检测结果进行了比较评价。比较统计学分析结果可以发现：MALDI-MSI-PTMA和LC-MS检测效能具有高度一致性，表明MALDI-MSI-PTMA一定程度上可以媲美LC-MS代谢分子检测效果。然而需要特别指出的是：LC-MS完成一个样本检测所消耗的时间大致为15-30 min，且需要较为复杂的样本前处理过程；相比之下，MALDI-MSI-PTMA技术在激光扫描步长为150和300 µm时，分别仅需1.2和0.6 min即可完成对一个样本点 (直径为1.0 mm) 的检测，因此利用该技术在不间断的情况下每天即可完成1200-2400个样本的高质量检测。在此条件下，MALDI-MSI-PTMA的检测效率较LC-MS提高了12.5 ~ 50倍，因此也充分表明MALDI-MSI-PTMA技术具有高通量快速检测的优势。除此之外，利用MALDI-MSI-PTMA技术不仅可以实现植物样本代谢分子高通量检测，而且可以根据不同需求调整植物样本阵列点的尺寸，极大方便了多元实验设计需求。团队研究人员还基于MALD-MSI-PTMA的可视化能力成功对15种重要差异代谢分子 (VIP>1) 进行了质谱成像可视化表征，清楚展示了这些分子在三种不同处理组岩青兰叶子中存在明显表达差异，这对于植物精准组培技术的进一步发展具有重要现实意义。
不同处理岩青兰叶片PTMA代谢分子MALDI-MS检测效能比较
MALDI-MSI-PTMA和LC-MS对于三种不同处理岩青兰叶片代谢分子检测结果分析
三种不同处理岩青兰叶片15种主要差异代谢物 (VIP>1) MALDI-MSI-PTMA可视化表征
综上所述，团队研究人员开发的MALDI-MSI-PTMA技术完全克服了植物细胞特殊结构的局限性 (如表皮蜡、角质层和细胞壁)，不仅具有高通量代谢分子检测和成像性能、高稳定性数据采集和成像重构性能等优点，而且操作简便、无样本损失、易于推广。可预见，MALDI-MSI-PTMA有潜力成为植物代谢分子高通量分析一种强有力技术，并进一步推进植物代谢组学向前发展。
中央民族大学黄航君（硕士生）、刘海强（博士生）、马伟伟（硕士生）为该论文共同第一作者，中央民族大学王晓东教授和王俊丽教授为共同通讯作者。该项研究工作得到国家自然科学基金（31770384、21605164）、中央民族大学“双一流”学科建设项目（Yldxxk201819）、中央民族大学青年学术团队项目（10301-02200301）、国家民委重点实验室建设基金（10301-02200303）等资助。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14154。
（转自PBJ 植物生物技术Pbj ，周宜君，王乔审校）
